Identifying ENO1 as a protein target of chlorogenic acid to inhibit cellular senescence and prevent skin photoaging in mice
2024年12月31日，中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所王繼剛教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康系朱銀華副教授在Aging Cell上發(fā)表題為“Identifying ENO1 as a protein target of chlorogenic acid to inhibit cellular senescence and prevent skin photoaging in mice”的文章。綠原酸顯著抑制UVA誘導(dǎo)的人真皮皮膚成纖維細(xì)胞（HDF）衰老?；诨钚缘牡鞍踪|(zhì)譜分析（ABPP）揭示ENO1是綠原酸在HDF細(xì)胞中的直接靶點(diǎn)。機(jī)制上，綠原酸共價結(jié)合ENO1，并通過抑制ENO1蛋白的活性來阻斷糖酵解途徑來阻止UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。
研究背景
1、光老化是由于皮膚長期暴露于紫外線（UV）輻射引起的皮膚老化過程，與皮膚癌的發(fā)生密切相關(guān)。
2、現(xiàn)有的防止或治療皮膚光老化的方法（如藥物療法、化學(xué)剝脫、微波療法和激光療法等）只能在一定程度上緩解光老化，且都有各自的缺陷。
3、綠原酸是一種重要的生物活性膳食多酚，具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用，能夠減少ROS產(chǎn)生和炎癥細(xì)胞因子釋放。然而，綠原酸在防止皮膚光老化中的具體機(jī)制尚不明確。
研究方法
1、使用ABPP技術(shù)篩選綠原酸在衰老HDF細(xì)胞中的蛋白靶點(diǎn)。首先設(shè)計(jì)并合成了綠原酸化學(xué)探針（綠原酸-P），通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)與熒光染料或生物素結(jié)合，用于標(biāo)記其結(jié)合蛋白。
2、通過一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證綠原酸與ENO1的相互作用，包括pull-down實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移分析（CETSA）、免疫熒光染色和LC-MS/MS分析。結(jié)果表明，綠原酸通過Cys399殘基與ENO1共價結(jié)合。
3、使用MicroScale Thermophoresis（MST）和位點(diǎn)定向突變技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證綠原酸與ENO1的結(jié)合位點(diǎn)。MST結(jié)果顯示，綠原酸與野生型ENO1的親和力（Kd = 20 μM）遠(yuǎn)高于突變蛋白（Kd = 130 μM）。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
1、綠原酸在體外實(shí)驗(yàn)中有效防止了UVA誘導(dǎo)的HDF細(xì)胞衰老，表現(xiàn)為減少SAβ-gal染色陽性細(xì)胞比例、降低ROS水平、抑制p16和p21蛋白表達(dá)以及減少炎癥因子TNFα和IL-6的釋放。
2、在小鼠模型中，綠原酸顯著減輕了UVR誘導(dǎo)的皮膚光老化現(xiàn)象。具體表現(xiàn)為減少皮膚皺紋、改善皮膚彈性、減輕表皮角化過度和真皮炎癥浸潤。
3、通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，綠原酸處理后，UVR上調(diào)的糖酵解相關(guān)蛋白被下調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了綠原酸通過抑制ENO1活性來抑制糖酵解途徑，從而延緩細(xì)胞衰老。
結(jié)果與分析
1、綠原酸顯著提高了ENO1蛋白的熱穩(wěn)定性，并通過Cys399殘基與ENO1共價結(jié)合。
2、綠原酸抑制了UVA誘導(dǎo)的HDF細(xì)胞中ENO1的酶活性，減少了糖酵解產(chǎn)物NAD+/NADH比率的增加，降低了乳酸脫氫酶（LD）和丙酮酸（PA）水平。
3、在小鼠模型中，綠原酸顯著減少了皮膚皺紋評分，改善了皮膚病理特征，并降低了血清中TNFα、IL1β和IL6的水平。
總體結(jié)論
1、綠原酸通過抑制ENO1活性，阻斷糖酵解途徑，從而有效防止UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老和皮膚光老化。
2、這項(xiàng)研究首次揭示了綠原酸在抗衰老細(xì)胞中的蛋白靶點(diǎn)和作用機(jī)制，表明綠原酸作為一種天然多酚，具有顯著的抗皮膚老化潛力。未來的研究應(yīng)繼續(xù)探索綠原酸的作用機(jī)制，并優(yōu)化其濃度和給藥時間，以推動其在臨床中的應(yīng)用。